《J Clin Invest》解读：TRIM56通过泛素化修饰FASN延缓NAFLD进展
非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）是全球最常见的慢性肝脏疾病。迄今为止，美国或欧洲药品管理局尚未批准任何抗NAFLD药物。因此，亟待深入了解该疾病的发病机制并研发针对NAFLD的靶向治疗药物。
2024年3月，中国科学技术大学翁建平教授团队在Journal of Clinical Investigation（IF=13.3）上发表了题为“TRIM56 protects against nonalcoholic fatty liver disease by promoting the degradation of fatty acid synthase”的研究成果。揭示了靶向TRIM56-FASN 轴在治疗NAFLD中的巨大潜力。
图形摘要：
Highlights如下：
1）基于siRNA 文库筛选，通过高内涵成像进行尼罗红染色，发现TRIM56 是脂质积累的突出抑制因子；
2）TRIM56在NAFLD患者和喂食高脂肪饮食的小鼠的肝脏中显著下调；
3）抑制TRIM56加剧NAFLD的进展，而TRIM56过表达则抑制NAFLD的进展；
4）通过整合人工智能辅助的药物发现，FASstatin是一种新型FASN抑制剂；
5）机制上，TRIM56直接与FASN相互作用，并触发其k48相关的泛素化依赖性降解，从而延缓NAFLD进展。
表达相关性：TRIM56在NAFLD患者和喂食高脂肪饮食的小鼠的肝脏中显著下调。
功能研究：肝细胞特异性敲除TRIM56加剧NAFLD的进展，而肝脏TRIM56过表达抑制NAFLD的进展。治疗性给药FASstatin可改善小鼠NAFLD和NASH病理。
机制研究：
（1）筛选TRIM56的候选互作蛋白——FASN
为了深入了解TRIM56调节NAFLD的可能机制，对TRIM56-HepKO肝组织中的TRIM56相互作用组学（BioGrid）和转录组学数据进行综合分析，FASN成为重点候选互作基因（图1a-c）。对TRIM56-KO小鼠肝细胞中TRIM56互作组学和转录组学综合分析得出类似的结果（图1d-e）。Western blot结果显示FASN在原代小鼠肝细胞和过表达TRIM56的人肝细胞系中表达降低（图1f-g）。此外，Trim56-HepKO小鼠的肝组织以及Trim56-KO小鼠的原代肝细胞中FASN以及脂肪酸代谢致病过程中下游脂肪生成级联蛋白的表达均有所增加（图1h-i）。表明，TRIM56与FASN表达呈负相关。
图1 FASN作为TRIM56互作蛋白的鉴定（Ref. Fig 4）
（2）TRIM56与FASN相互作用
第一步，验证TRIM56与FASN互作
根据上述检测结果，推测TRIM56与FASN相互作用并促进其降解。Co-IP和GST pulldown实验发现TRIM56与FASN相互作用（图2a-e）。表面等离子体共振（SPR）分析支持TRIM56直接与FASN相互作用（图2f）。
第二步，确定TRIM56与FASN互作区域
TRIM56由一个高度保守的RING结构域、2个B -box结构域和一个线圈结构域（CC）以及一个具有功能特异性的C端结构域（CTD）组成。构建不同的TRIM56截断体进行Co-IP实验，发现TRIM56的aa 522-755对于TRIM56与FASN之间的互作至关重要（图2g）。细胞学实验显示，TRIM56全长过表达，而非TRIM56 (1-521 aa) 减少了肝细胞内TG积累和脂质积累（图2h）。此外，TRIM56 （1 - 521aa）过表达对脂肪生成相关蛋白或基因的表达也没有影响（图2i-j）。表明TRIM56通过aa 522-755区域与FASN互作。
图2 TRIM56与FASN相互作用（Ref. Fig 5）
（3）TRIM56与FASN互作，并促进FASN降解
第一步，确定TRIM56促使FASN泛素化位点
为了进一步研究trim56介导的FASN降解的分子机制，过表达FLAG-TRIM56，并用氯喹（一种溶酶体依赖蛋白降解的药物抑制剂）或MG132（一种蛋白酶体依赖蛋白降解的抑制剂）治疗肝细胞，Western blot分析显示，TRIM56过表达诱导的FASN下调是由MG132挽救的，表明蛋白酶体依赖性的FASN降解可能起主要作用（图3a）。IP-WB实验显示TRIM56过表达导致FASN泛素化增强（图3b-c）。泛素中存在多个位点会导致底物泛素化，研究了泛素化的具体位点，Co-IP实验发现K48链的多泛素化在FASN的多泛素化中发挥了主要作用（图3d）。在K48O过表达的细胞中，FASN的泛素化增加，而K48R过表达的细胞则没有增加，这进一步证实了这一点（图3e）。表明TRIM56使FASN的K48链发生泛素化。
第二步，TRIM56对FASN的泛素化，依赖TRIM56 CTD区域与FASN互作
前面的结果显示TRIM56的CTD （522-755 aa）与FASN相互作用。IP-WB实验显示，过表达TRIM56 （1-521 aa）片段（无法与FASN结合）未能增加FASN多泛素化（图3f），表明522-575位点aa对于TRIM56-FASN相互作用和FASN蛋白不稳定性至关重要。
第三步，TRIM56对FASN的泛素化，依赖其E3泛素连接酶活性
构建TRIM56 (21AACC24) （E3泛素连接酶活性缺陷突变体），IP-WB实验发现TRIM56酶失活突变体未能增加FASN蛋白的泛素化（图3g）。与该结果一致，WT TRIM56，而不是TRIM56 （21AACC24）突变体，减少了PO（棕榈酸/油酸）诱导的脂质积累和TG升高（图3h）。此外，TRIM56 （21AACC24）不影响脂肪生成相关基因或蛋白的表达（图3i-j）。表明，TRIM56通过与FASN和共轭K48链的泛素化链相互作用来抑制肝细胞脂肪变性，促进FASN的降解。
图3 TRIM56与FASN互作，并促进FASN降解；AI筛选鉴定FASstatin为FASN抑制剂（Ref. Fig 6/8）
（4）基于人工智能的化合物筛选鉴定FASstatin为FASN抑制剂
第一步，AI筛选FASN抑制剂的先导化合物
基于前面的结果，FASN是NAFLD发病机制的主要调节因子。为了筛选FASN抑制剂，对由12亿个小分子化合物组成的药物文库进行基于AI筛选，结合细胞活性实验，从选择的14个化合物中筛选出FASstatin作为最优候选（图3k-l）。
第二步，验证FASstatin与FASN结合
分子对接分析表明FASstatin可能与FASN蛋白存在结合模式（图3m）。SPR分析显示FASstatin直接结合FASN (kDa = 1.6 × 10-5 M)（图3n）。生物素标记的FASstatin pulldown实验发现FASstatin与FASN结合（图3o）。随后检测了其细胞学活性。
第三步，FASstatin促进TRIM56依赖性FASN泛素化
由于TRIM56是一种促进FASN蛋白降解的E3连接酶，那么FASstatin是否促进TRIM56依赖性FASN泛素化？Co-IP实验显示，TRIM56-FASN相互作用和TRIM56介导的FASN K48多泛素化在FASstatin治疗后显著增加（图3p-r）。表明，FASstatin促进TRIM56依赖性FASN泛素化。
结论：研究者通过从转录组分析到siRNA文库的多层筛选，发现TRIM蛋白家族在肝脂肪变性和NAFLD发展中发挥重要作用。在 TRIM 家族成员中，TRIM56可以直接与 FASN 相互作用并促进其降解，为肝脏脂质堆积的内源性负调节因子。通过整合人工智能辅助的药物发现，发现了一种新型FASN抑制剂——FASstatin，可以促进TRIM56介导的FASN蛋白降解并抑制小鼠NAFLD。揭示了靶向TRIM56-FASN 轴在治疗NAFLD中的巨大潜力。
非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）是全球最常见的慢性肝脏疾病。迄今为止，美国或欧洲药品管理局尚未批准任何抗NAFLD药物。因此，亟待深入了解该疾病的发病机制并研发针对NAFLD的靶向治疗药物。
2024年3月，中国科学技术大学翁建平教授团队在Journal of Clinical Investigation（IF=13.3）上发表了题为“TRIM56 protects against nonalcoholic fatty liver disease by promoting the degradation of fatty acid synthase”的研究成果。揭示了靶向TRIM56-FASN 轴在治疗NAFLD中的巨大潜力。
图形摘要：
Highlights如下：
1）基于siRNA 文库筛选，通过高内涵成像进行尼罗红染色，发现TRIM56 是脂质积累的突出抑制因子；
2）TRIM56在NAFLD患者和喂食高脂肪饮食的小鼠的肝脏中显著下调；
3）抑制TRIM56加剧NAFLD的进展，而TRIM56过表达则抑制NAFLD的进展；
4）通过整合人工智能辅助的药物发现，FASstatin是一种新型FASN抑制剂；
5）机制上，TRIM56直接与FASN相互作用，并触发其k48相关的泛素化依赖性降解，从而延缓NAFLD进展。
表达相关性：TRIM56在NAFLD患者和喂食高脂肪饮食的小鼠的肝脏中显著下调。
功能研究：肝细胞特异性敲除TRIM56加剧NAFLD的进展，而肝脏TRIM56过表达抑制NAFLD的进展。治疗性给药FASstatin可改善小鼠NAFLD和NASH病理。
机制研究：
（1）筛选TRIM56的候选互作蛋白——FASN
为了深入了解TRIM56调节NAFLD的可能机制，对TRIM56-HepKO肝组织中的TRIM56相互作用组学（BioGrid）和转录组学数据进行综合分析，FASN成为重点候选互作基因（图1a-c）。对TRIM56-KO小鼠肝细胞中TRIM56互作组学和转录组学综合分析得出类似的结果（图1d-e）。Western blot结果显示FASN在原代小鼠肝细胞和过表达TRIM56的人肝细胞系中表达降低（图1f-g）。此外，Trim56-HepKO小鼠的肝组织以及Trim56-KO小鼠的原代肝细胞中FASN以及脂肪酸代谢致病过程中下游脂肪生成级联蛋白的表达均有所增加（图1h-i）。表明，TRIM56与FASN表达呈负相关。
图1 FASN作为TRIM56互作蛋白的鉴定（Ref. Fig 4）
（2）TRIM56与FASN相互作用
第一步，验证TRIM56与FASN互作
根据上述检测结果，推测TRIM56与FASN相互作用并促进其降解。Co-IP和GST pulldown实验发现TRIM56与FASN相互作用（图2a-e）。表面等离子体共振（SPR）分析支持TRIM56直接与FASN相互作用（图2f）。
第二步，确定TRIM56与FASN互作区域
TRIM56由一个高度保守的RING结构域、2个B -box结构域和一个线圈结构域（CC）以及一个具有功能特异性的C端结构域（CTD）组成。构建不同的TRIM56截断体进行Co-IP实验，发现TRIM56的aa 522-755对于TRIM56与FASN之间的互作至关重要（图2g）。细胞学实验显示，TRIM56全长过表达，而非TRIM56 (1-521 aa) 减少了肝细胞内TG积累和脂质积累（图2h）。此外，TRIM56 （1 - 521aa）过表达对脂肪生成相关蛋白或基因的表达也没有影响（图2i-j）。表明TRIM56通过aa 522-755区域与FASN互作。
图2 TRIM56与FASN相互作用（Ref. Fig 5）
（3）TRIM56与FASN互作，并促进FASN降解
第一步，确定TRIM56促使FASN泛素化位点
为了进一步研究trim56介导的FASN降解的分子机制，过表达FLAG-TRIM56，并用氯喹（一种溶酶体依赖蛋白降解的药物抑制剂）或MG132（一种蛋白酶体依赖蛋白降解的抑制剂）治疗肝细胞，Western blot分析显示，TRIM56过表达诱导的FASN下调是由MG132挽救的，表明蛋白酶体依赖性的FASN降解可能起主要作用（图3a）。IP-WB实验显示TRIM56过表达导致FASN泛素化增强（图3b-c）。泛素中存在多个位点会导致底物泛素化，研究了泛素化的具体位点，Co-IP实验发现K48链的多泛素化在FASN的多泛素化中发挥了主要作用（图3d）。在K48O过表达的细胞中，FASN的泛素化增加，而K48R过表达的细胞则没有增加，这进一步证实了这一点（图3e）。表明TRIM56使FASN的K48链发生泛素化。
第二步，TRIM56对FASN的泛素化，依赖TRIM56 CTD区域与FASN互作
前面的结果显示TRIM56的CTD （522-755 aa）与FASN相互作用。IP-WB实验显示，过表达TRIM56 （1-521 aa）片段（无法与FASN结合）未能增加FASN多泛素化（图3f），表明522-575位点aa对于TRIM56-FASN相互作用和FASN蛋白不稳定性至关重要。
第三步，TRIM56对FASN的泛素化，依赖其E3泛素连接酶活性
构建TRIM56 (21AACC24) （E3泛素连接酶活性缺陷突变体），IP-WB实验发现TRIM56酶失活突变体未能增加FASN蛋白的泛素化（图3g）。与该结果一致，WT TRIM56，而不是TRIM56 （21AACC24）突变体，减少了PO（棕榈酸/油酸）诱导的脂质积累和TG升高（图3h）。此外，TRIM56 （21AACC24）不影响脂肪生成相关基因或蛋白的表达（图3i-j）。表明，TRIM56通过与FASN和共轭K48链的泛素化链相互作用来抑制肝细胞脂肪变性，促进FASN的降解。
图3 TRIM56与FASN互作，并促进FASN降解；AI筛选鉴定FASstatin为FASN抑制剂（Ref. Fig 6/8）
（4）基于人工智能的化合物筛选鉴定FASstatin为FASN抑制剂
第一步，AI筛选FASN抑制剂的先导化合物
基于前面的结果，FASN是NAFLD发病机制的主要调节因子。为了筛选FASN抑制剂，对由12亿个小分子化合物组成的药物文库进行基于AI筛选，结合细胞活性实验，从选择的14个化合物中筛选出FASstatin作为最优候选（图3k-l）。
第二步，验证FASstatin与FASN结合
分子对接分析表明FASstatin可能与FASN蛋白存在结合模式（图3m）。SPR分析显示FASstatin直接结合FASN (kDa = 1.6 × 10-5 M)（图3n）。生物素标记的FASstatin pulldown实验发现FASstatin与FASN结合（图3o）。随后检测了其细胞学活性。
第三步，FASstatin促进TRIM56依赖性FASN泛素化
由于TRIM56是一种促进FASN蛋白降解的E3连接酶，那么FASstatin是否促进TRIM56依赖性FASN泛素化？Co-IP实验显示，TRIM56-FASN相互作用和TRIM56介导的FASN K48多泛素化在FASstatin治疗后显著增加（图3p-r）。表明，FASstatin促进TRIM56依赖性FASN泛素化。
结论：研究者通过从转录组分析到siRNA文库的多层筛选，发现TRIM蛋白家族在肝脂肪变性和NAFLD发展中发挥重要作用。在 TRIM 家族成员中，TRIM56可以直接与 FASN 相互作用并促进其降解，为肝脏脂质堆积的内源性负调节因子。通过整合人工智能辅助的药物发现，发现了一种新型FASN抑制剂——FASstatin，可以促进TRIM56介导的FASN蛋白降解并抑制小鼠NAFLD。揭示了靶向TRIM56-FASN 轴在治疗NAFLD中的巨大潜力。
