一、原理 多重免疫组化（mIHC）是一项先进技术，能在单张组织切片上同时检测多个靶标。该技术主要依托酪胺信号放大技术（Tyramide signal amplification, TSA）。简单来讲，TSA技术属于一类借助辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测手段。
TSA荧光染料由酪胺分子(tyramine，T)与荧光染料偶联构成。在过氧化氢(H₂O₂)环境里，非活性的酪胺分子(T)被与二抗偶联的HRP催化激活，大量发生酶促反应，转变为具有短暂活性的中间态分子(T*)，并形成共价键结合位点，与邻近蛋白（涵盖靶抗原蛋白、一抗、二抗及HRP）的富电子区域（如色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基）通过共价键偶联而沉积。
如此一来，偶联在酪胺分子上的荧光染料也在共价偶联蛋白周围大量沉积，信号由此得到有效放大。由于抗原—酪胺蛋白间共价键的键能稳定性远超抗原—抗体间的非共价键结合力，之后借助微波修复，洗去结合在抗原上的一抗—HRP二抗—TSA染料复合物，仅保留与抗原偶联的TSA荧光染料信号。接着更换针对不同靶蛋白的抗体、不同激发波长和发射波长的TSA染料，进行第二轮孵育，依此循环，经多轮复染便可实现组织的原位多靶点染色（最多可达八标九色）。
二、HE染色评估组织质量
对全部样本开展HE染色，以此评估取材、组织脱水、包埋、切片等步骤是否达标。
三、免疫组化测试一抗
先利用阳性组织石蜡切片确定一抗的有效浓度（设定低、中、高3个浓度梯度），再依据染色状况进一步调整。
四、TSA染料单标测试确定一抗浓度和染料搭配
组织自发荧光（Autofluorescence, AF）的检测：在进行免疫荧光染色前，需评估样本的自发荧光。自发荧光是样本在未染色时，因组织内固有荧光物质受特定波长照射而发出的光。运用光谱成像系统记录组织自发荧光的光谱特性，以便在后续实验中防止自发荧光与目标信号重叠。也就是说，为靶蛋白挑选荧光染料时，应选激发波长与组织自发荧光波长不同的染料，降低自发荧光对实验结果的干扰。
使用TSA技术对单个靶标蛋白染色。在多重免疫荧光成像（例如使用多光谱成像系统）过程中，记录每个靶标的荧光信号曝光强度。依据记录的曝光强度和荧光信号，判断染色结果是否符合以下标准：
- 特异性：荧光信号应仅出现在目标蛋白处，阴性对照区域不应有非特异性信号。
- 曝光时间：理想的信号曝光时间应控制在50 - 200毫秒，确保信号清晰且对比度良好。
- 曝光时间均衡：不同荧光通道的曝光时间应尽量均衡，相差不超10倍，保证图像的一致性。
- 同一激发通道的靶标：若多个靶标使用相同激发波长，它们的曝光时间应相近，以确保信号具有可比性。
TSA单标染色所用一抗稀释度需依据IHC染色验证的DAB显色时间确定：若DAB显色时间为20 - 30秒，则将IHC验证好的一抗稀释度再稀释2倍；若DAB显色时间为40秒 - 1分钟，则将一抗稀释度再稀释1倍。
五、实验流程
需在前3个阶段都收获满意结果后，方可进行多重荧光免疫组化染色。正式实验前，选取1 - 2个小样本开展小量mIHC预实验，明确靶蛋白的染色顺序，确定后开展正式实验，注意不要随意变动TSA染料单标染色已验证好的实验条件，如一抗稀释度和孵育条件、抗原修复液类型和修复条件、二抗试剂种类和孵育条件。
1、切片、烤片及烘片 • 切片：采用粘附载玻片，肠癌组织切片厚度设为5μm。若为组织芯片，需准备与组织芯片组织类型对应的常规组织切片，用于摸索预实验条件。 • 烤片：切片后立即烤片，先在60℃烘烤6 - 8小时，再于40℃过夜保存，注意避免光照。切片需在一个月内使用。此步骤可防止组织在后续处理过程中脱落。 • 实验前烘片：实验前，将石蜡切片在60℃烘片1小时。目的是增强组织与载玻片的粘附力，防止染色过程中组织脱落。
2、脱蜡水合 • 二甲苯脱蜡：用新鲜二甲苯浸片10分钟，重复3次；或浸片30分钟，重复2次。这一步旨在去除切片中的石蜡，因为石蜡会妨碍抗体与抗原结合。 • 梯度乙醇浸片：依次用100%乙醇浸片5分钟，重复2次；95%乙醇浸片5分钟；90%乙醇浸片5分钟；80%乙醇浸片5分钟。 • 灭菌水洗片：用灭菌水浸片1分钟，重复3次。此过程有助于组织从有机溶剂环境温和过渡到水环境，避免细胞和组织结构受损。 • 后固定：用10%中性福尔马林浸片10分钟，然后用灭菌水洗片1分钟，重复3次。该步骤用于固定组织样本，维持细胞和组织结构的完整性，防止处理过程中组织变性或破坏。
3、封闭内源性过氧化氢酶(可选用) • 新鲜配制3%H₂O₂：将20ml H₂O₂ (30%)与180ml milipore H₂O混合。 • 3%H₂O₂浸片：将切片浸入3%H₂O₂溶液15分钟。 • 水洗：用清水洗片3次，每次1分钟。此步骤可封闭组织中的内源性过氧化氢酶，避免其在显色反应中产生背景染色，提高特异性。
4、微波修复抗原 • 将抗原修复液放入修复杯，置于微波炉内高火加热5分钟，直至煮沸。 • 把脱蜡水合后的玻片放入预煮沸的抗原修复液中，确保片子完全浸没。 • 用低火维持15分钟（注意补充液体，防止因蒸发过度导致干片）。 • 取出后放入冰水水浴中，冷却至室温。此步骤能开放蛋白质的抗原表位，使抗体更易与目标抗原结合，提升染色效果。
5、封闭 • 去除玻片上残留的洗液。 • 用组化笔在玻片上圈出样本区域，滴加封闭液，覆盖样本。 • 在室温下保湿振荡10分钟。此操作可避免抗体在非目标区域非特异性结合，减少背景染色。
6、一抗孵育 • 去除玻片上的封闭液。 • 用移液器滴加稀释后的一抗溶液，浸没样本区域。 • 在室温或37℃下保湿振荡孵育1 - 2小时（不同抗体需做优化调整）。 • 用1×TBST buffer浸洗玻片3分钟，重复3次。
7、二抗孵育 • 去除玻片上残留的洗液。 • 直接滴加HRP标记的二抗工作液，浸没样本区域。 • 在室温下保湿孵育10分钟。 • 用1×TBST buffer浸洗玻片3分钟，重复3次。
8、荧光染色放大信号 • 去除玻片上残留的洗液。 • 滴加1×TSA染料工作液100μL（用信号放大反应液按1:100稀释），浸没样本区域，放大信号，增强荧光信号强度，便于检测目标蛋白。 • 在室温下保湿振荡孵育10分钟。 • 用1×TBST buffer在室温下浸洗玻片3分钟，重复3次。 • 进行微波修复洗脱，然后室温自然冷却。 • 用灭菌水洗片1次，再用1×TBST buffer洗2分钟。 • 本轮染色结束，追加后续染色，重复第6步到第9步。
9、封片 • 去除玻片上残留的洗液，滴加DAPI工作液，在室温下保湿孵育10分钟。DAPI用于染色核酸，通常标记细胞核，为细胞定位提供参照。 • 用1×TBST buffer在室温下浸洗玻片3分钟，重复3次。 • 用灭菌水洗片。 • 待玻片微微干燥，用移液器在玻片上滴加抗淬灭封片剂，浸没样本区域。 • 加盖玻片，用指甲油封片。
10、阅片 • 对染色后的组织切片，使用激光共聚焦荧光显微镜或多光谱组织成像系统进行观察与成像，并对结果进行判读。
TSA荧光染料由酪胺分子(tyramine，T)与荧光染料偶联构成。在过氧化氢(H₂O₂)环境里，非活性的酪胺分子(T)被与二抗偶联的HRP催化激活，大量发生酶促反应，转变为具有短暂活性的中间态分子(T*)，并形成共价键结合位点，与邻近蛋白（涵盖靶抗原蛋白、一抗、二抗及HRP）的富电子区域（如色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基）通过共价键偶联而沉积。
如此一来，偶联在酪胺分子上的荧光染料也在共价偶联蛋白周围大量沉积，信号由此得到有效放大。由于抗原—酪胺蛋白间共价键的键能稳定性远超抗原—抗体间的非共价键结合力，之后借助微波修复，洗去结合在抗原上的一抗—HRP二抗—TSA染料复合物，仅保留与抗原偶联的TSA荧光染料信号。接着更换针对不同靶蛋白的抗体、不同激发波长和发射波长的TSA染料，进行第二轮孵育，依此循环，经多轮复染便可实现组织的原位多靶点染色（最多可达八标九色）。
二、HE染色评估组织质量
对全部样本开展HE染色，以此评估取材、组织脱水、包埋、切片等步骤是否达标。
三、免疫组化测试一抗
先利用阳性组织石蜡切片确定一抗的有效浓度（设定低、中、高3个浓度梯度），再依据染色状况进一步调整。
四、TSA染料单标测试确定一抗浓度和染料搭配
组织自发荧光（Autofluorescence, AF）的检测：在进行免疫荧光染色前，需评估样本的自发荧光。自发荧光是样本在未染色时，因组织内固有荧光物质受特定波长照射而发出的光。运用光谱成像系统记录组织自发荧光的光谱特性，以便在后续实验中防止自发荧光与目标信号重叠。也就是说，为靶蛋白挑选荧光染料时，应选激发波长与组织自发荧光波长不同的染料，降低自发荧光对实验结果的干扰。
使用TSA技术对单个靶标蛋白染色。在多重免疫荧光成像（例如使用多光谱成像系统）过程中，记录每个靶标的荧光信号曝光强度。依据记录的曝光强度和荧光信号，判断染色结果是否符合以下标准：
- 特异性：荧光信号应仅出现在目标蛋白处，阴性对照区域不应有非特异性信号。
- 曝光时间：理想的信号曝光时间应控制在50 - 200毫秒，确保信号清晰且对比度良好。
- 曝光时间均衡：不同荧光通道的曝光时间应尽量均衡，相差不超10倍，保证图像的一致性。
- 同一激发通道的靶标：若多个靶标使用相同激发波长，它们的曝光时间应相近，以确保信号具有可比性。
TSA单标染色所用一抗稀释度需依据IHC染色验证的DAB显色时间确定：若DAB显色时间为20 - 30秒，则将IHC验证好的一抗稀释度再稀释2倍；若DAB显色时间为40秒 - 1分钟，则将一抗稀释度再稀释1倍。
五、实验流程
需在前3个阶段都收获满意结果后，方可进行多重荧光免疫组化染色。正式实验前，选取1 - 2个小样本开展小量mIHC预实验，明确靶蛋白的染色顺序，确定后开展正式实验，注意不要随意变动TSA染料单标染色已验证好的实验条件，如一抗稀释度和孵育条件、抗原修复液类型和修复条件、二抗试剂种类和孵育条件。
1、切片、烤片及烘片 • 切片：采用粘附载玻片，肠癌组织切片厚度设为5μm。若为组织芯片，需准备与组织芯片组织类型对应的常规组织切片，用于摸索预实验条件。 • 烤片：切片后立即烤片，先在60℃烘烤6 - 8小时，再于40℃过夜保存，注意避免光照。切片需在一个月内使用。此步骤可防止组织在后续处理过程中脱落。 • 实验前烘片：实验前，将石蜡切片在60℃烘片1小时。目的是增强组织与载玻片的粘附力，防止染色过程中组织脱落。
2、脱蜡水合 • 二甲苯脱蜡：用新鲜二甲苯浸片10分钟，重复3次；或浸片30分钟，重复2次。这一步旨在去除切片中的石蜡，因为石蜡会妨碍抗体与抗原结合。 • 梯度乙醇浸片：依次用100%乙醇浸片5分钟，重复2次；95%乙醇浸片5分钟；90%乙醇浸片5分钟；80%乙醇浸片5分钟。 • 灭菌水洗片：用灭菌水浸片1分钟，重复3次。此过程有助于组织从有机溶剂环境温和过渡到水环境，避免细胞和组织结构受损。 • 后固定：用10%中性福尔马林浸片10分钟，然后用灭菌水洗片1分钟，重复3次。该步骤用于固定组织样本，维持细胞和组织结构的完整性，防止处理过程中组织变性或破坏。
3、封闭内源性过氧化氢酶(可选用) • 新鲜配制3%H₂O₂：将20ml H₂O₂ (30%)与180ml milipore H₂O混合。 • 3%H₂O₂浸片：将切片浸入3%H₂O₂溶液15分钟。 • 水洗：用清水洗片3次，每次1分钟。此步骤可封闭组织中的内源性过氧化氢酶，避免其在显色反应中产生背景染色，提高特异性。
4、微波修复抗原 • 将抗原修复液放入修复杯，置于微波炉内高火加热5分钟，直至煮沸。 • 把脱蜡水合后的玻片放入预煮沸的抗原修复液中，确保片子完全浸没。 • 用低火维持15分钟（注意补充液体，防止因蒸发过度导致干片）。 • 取出后放入冰水水浴中，冷却至室温。此步骤能开放蛋白质的抗原表位，使抗体更易与目标抗原结合，提升染色效果。
5、封闭 • 去除玻片上残留的洗液。 • 用组化笔在玻片上圈出样本区域，滴加封闭液，覆盖样本。 • 在室温下保湿振荡10分钟。此操作可避免抗体在非目标区域非特异性结合，减少背景染色。
6、一抗孵育 • 去除玻片上的封闭液。 • 用移液器滴加稀释后的一抗溶液，浸没样本区域。 • 在室温或37℃下保湿振荡孵育1 - 2小时（不同抗体需做优化调整）。 • 用1×TBST buffer浸洗玻片3分钟，重复3次。
7、二抗孵育 • 去除玻片上残留的洗液。 • 直接滴加HRP标记的二抗工作液，浸没样本区域。 • 在室温下保湿孵育10分钟。 • 用1×TBST buffer浸洗玻片3分钟，重复3次。
8、荧光染色放大信号 • 去除玻片上残留的洗液。 • 滴加1×TSA染料工作液100μL（用信号放大反应液按1:100稀释），浸没样本区域，放大信号，增强荧光信号强度，便于检测目标蛋白。 • 在室温下保湿振荡孵育10分钟。 • 用1×TBST buffer在室温下浸洗玻片3分钟，重复3次。 • 进行微波修复洗脱，然后室温自然冷却。 • 用灭菌水洗片1次，再用1×TBST buffer洗2分钟。 • 本轮染色结束，追加后续染色，重复第6步到第9步。
9、封片 • 去除玻片上残留的洗液，滴加DAPI工作液，在室温下保湿孵育10分钟。DAPI用于染色核酸，通常标记细胞核，为细胞定位提供参照。 • 用1×TBST buffer在室温下浸洗玻片3分钟，重复3次。 • 用灭菌水洗片。 • 待玻片微微干燥，用移液器在玻片上滴加抗淬灭封片剂，浸没样本区域。 • 加盖玻片，用指甲油封片。
10、阅片 • 对染色后的组织切片，使用激光共聚焦荧光显微镜或多光谱组织成像系统进行观察与成像，并对结果进行判读。
