简牍：疾病靶点泛素修饰调控机制研究思路。
Step1：根据临床需求和文献，凝练临床科学问题。
Step2：根据临床科学问题，确定泛素修饰靶点。
Step3：明确修饰靶点的细胞动物模型功能
Step4：解析泛素修饰酶，修饰类型和位点、以及下游机制分子调控方式等。该研究为病理提供新视角、为诊疗提
供新策略。
正文： 互作机制研究是临床基础研究的难点，修饰互作机制研究是互作机制研究上的明珠。泛素化修饰机制研究，主要目标是深入理解泛素化过程如何精确调控蛋白质的功能，以及这些调控如何影响细胞生理和病理过程。 在解读泛素化修饰的研究文献，同时结合泛素化修饰研究中的实践经验，我们对医学泛素修饰的研究思路进行提炼总结，尝试从以下几个方面进行梳理，供大家参考！
1. 泛素化修饰体系简介
泛素化修饰是细胞内一种高度保守且复杂的蛋白质调控机制，通过泛素分子（76aa）的共价结合，调控蛋白质的稳定性、定位、活性及相互作用，进而影响细胞功能、信号转导、细胞周期、免疫反应、细胞凋亡等多种生物学过程。涉及的泛素修饰体系，如下：
泛素连接酶（E1、E2、E3）：其中E3连接酶是泛素修饰系统的关键酶，人E3泛素连接酶大概有666个。Ubibrower2.0和UbiNet2.0数据库中显示的E3连接酶和底物互作对已高达4068对。
去泛素酶（DUB）：去除泛素修饰，人大概86个去泛素化酶。Ubibrower2.0和UbiNet2.0数据库中显示的DUB和底物互作对已有967对。
泛素修饰的类型：共7种泛素化修饰类型，包括K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63修饰。在泛素修饰中，E3连接酶通过泛素蛋白不同位点的赖氨酸（K）残基与底物蛋白结合，从而形成不同类型的泛素链，发挥不同的作用（表1）。
表1. 泛素修饰类型功效简介
2. 疾病泛素修饰相关蛋白靶点的开发
提炼科学问题：根据临床问题，广泛阅读文献，基于现有知识空白或临床需求，明确研究目标，可以是特定疾病中关键蛋白的泛素化调控机制，或是泛素化修饰异常分子与疾病发生发展的关系等。
疾病关键蛋白泛素化调控机制研究：结合生物信息学在线工具（UbPred和GPS-Uber），预测目标蛋白的可能泛素化位点。同时使用质谱定性检测（如4D-Shotgun鉴定技术）对目标靶蛋白进行泛素化修饰的鉴定，确定具体的泛素化位点。
疾病异常的泛素修饰蛋白分子开发：利用高通量质谱技术（如4D泛素化修饰组学技术），鉴定疾病相关的泛素化修饰蛋白。
3. 疾病靶蛋白泛素化修饰的验证
靶蛋白疾病功能验证：利用siRNA/shRNA敲减技术，过表达等技术，验证靶蛋白与疾病的关系。
CoIP-WB检测泛素化修饰：利用特异性抗体对修饰蛋白进行IP实验，使用泛素化抗体WB检测靶蛋白的泛素化水平。
4. 泛素连接酶与去泛素化酶的鉴定
CoIP-Mass检测或或HuProt蛋白组芯片检测技术：筛选与靶蛋白相互作用的泛素连接酶（E3）或去泛素化酶（DUBs）。同时结合在线预测数据库（UbiNet2.0和Ubibrower2.0）分析，快速锁定修饰酶。
CoIP-WB或Pulldown-WB技术：检测与靶蛋白相互作用的修饰酶。进一步通过双向CoIP结构域截断体互作验证，明确修饰酶和靶蛋白结合的功能结构域。
细胞遗传验证技术：利用siRNA/shRNA敲减、过表达等技术构建修饰酶细胞遗传模型，观察靶蛋白泛素化水平的变化。
5. 泛素修饰类型与靶蛋白修饰位点的鉴定
使用HA-Ub-WT/KO泛素修饰系统检测修饰类型：使用HA-Ub-WT和HA-Ub-KO（K6，K11，K27，K29，K33，K48和K63）载体，分别与泛素连接酶（E3）和修饰底物共转染细胞，通过CoIP-WB检测底物泛素化水平，明确泛素连接酶对修饰底物的泛素修饰类型。或再次使用HA-Ub-WT（K6R，K11R，K27R，K29R，K33R，K48R和K63R）载体，分别与泛素连接酶（E3）和修饰底物共转染细胞，通过CoIP-WB检测底物泛素化水平，再次明确泛素连接酶对修饰底物的泛素修饰类型。
使用靶蛋白修饰位点突变鉴定修饰位点：结合生物信息学在线工具（UbPred和GPS-Uber），预测可能的泛素化位点，构建靶蛋白的位点突变体，与HA-Ub-WT质粒和E3连接酶共转染细胞，通过CoIP-WB检测底物泛素化水平，明确修饰底物的关键修饰位点。
靶蛋白修饰突变体构建验证：构建靶蛋白的泛素化位点突变体，通过比较野生型与突变体的功能差异，验证泛素化位点的功能。
6. 靶蛋白泛素修饰的功能与机制解析
信号通路分析：利用RNA-seq转录组和4D-DIA蛋白组等技术，分析泛素化修饰如何影响靶蛋白参与的信号通路。
CoIP-Mass检测或HuProt蛋白组芯片检测技术：筛选与靶蛋白相互作用的关键机制分子。
CoIP-WB检测和功能验证：不同泛素修饰状态下，靶蛋白和下游机制分子的互作变化，以及这些变化对机制分子的功能影响。
总结：通过以上机制探索研究思路，可以全面深入地揭示泛素化修饰在细胞生理和病理过程中的作用机制，为疾病诊疗提供新的靶点和策略。如您有泛素修饰方面的科研问题，欢迎随时来撩！
Step1：根据临床需求和文献，凝练临床科学问题。
Step2：根据临床科学问题，确定泛素修饰靶点。
Step3：明确修饰靶点的细胞动物模型功能
Step4：解析泛素修饰酶，修饰类型和位点、以及下游机制分子调控方式等。该研究为病理提供新视角、为诊疗提
供新策略。
正文： 互作机制研究是临床基础研究的难点，修饰互作机制研究是互作机制研究上的明珠。泛素化修饰机制研究，主要目标是深入理解泛素化过程如何精确调控蛋白质的功能，以及这些调控如何影响细胞生理和病理过程。 在解读泛素化修饰的研究文献，同时结合泛素化修饰研究中的实践经验，我们对医学泛素修饰的研究思路进行提炼总结，尝试从以下几个方面进行梳理，供大家参考！
1. 泛素化修饰体系简介
泛素化修饰是细胞内一种高度保守且复杂的蛋白质调控机制，通过泛素分子（76aa）的共价结合，调控蛋白质的稳定性、定位、活性及相互作用，进而影响细胞功能、信号转导、细胞周期、免疫反应、细胞凋亡等多种生物学过程。涉及的泛素修饰体系，如下：
泛素连接酶（E1、E2、E3）：其中E3连接酶是泛素修饰系统的关键酶，人E3泛素连接酶大概有666个。Ubibrower2.0和UbiNet2.0数据库中显示的E3连接酶和底物互作对已高达4068对。
去泛素酶（DUB）：去除泛素修饰，人大概86个去泛素化酶。Ubibrower2.0和UbiNet2.0数据库中显示的DUB和底物互作对已有967对。
泛素修饰的类型：共7种泛素化修饰类型，包括K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63修饰。在泛素修饰中，E3连接酶通过泛素蛋白不同位点的赖氨酸（K）残基与底物蛋白结合，从而形成不同类型的泛素链，发挥不同的作用（表1）。
表1. 泛素修饰类型功效简介
2. 疾病泛素修饰相关蛋白靶点的开发
提炼科学问题：根据临床问题，广泛阅读文献，基于现有知识空白或临床需求，明确研究目标，可以是特定疾病中关键蛋白的泛素化调控机制，或是泛素化修饰异常分子与疾病发生发展的关系等。
疾病关键蛋白泛素化调控机制研究：结合生物信息学在线工具（UbPred和GPS-Uber），预测目标蛋白的可能泛素化位点。同时使用质谱定性检测（如4D-Shotgun鉴定技术）对目标靶蛋白进行泛素化修饰的鉴定，确定具体的泛素化位点。
疾病异常的泛素修饰蛋白分子开发：利用高通量质谱技术（如4D泛素化修饰组学技术），鉴定疾病相关的泛素化修饰蛋白。
3. 疾病靶蛋白泛素化修饰的验证
靶蛋白疾病功能验证：利用siRNA/shRNA敲减技术，过表达等技术，验证靶蛋白与疾病的关系。
CoIP-WB检测泛素化修饰：利用特异性抗体对修饰蛋白进行IP实验，使用泛素化抗体WB检测靶蛋白的泛素化水平。
4. 泛素连接酶与去泛素化酶的鉴定
CoIP-Mass检测或或HuProt蛋白组芯片检测技术：筛选与靶蛋白相互作用的泛素连接酶（E3）或去泛素化酶（DUBs）。同时结合在线预测数据库（UbiNet2.0和Ubibrower2.0）分析，快速锁定修饰酶。
CoIP-WB或Pulldown-WB技术：检测与靶蛋白相互作用的修饰酶。进一步通过双向CoIP结构域截断体互作验证，明确修饰酶和靶蛋白结合的功能结构域。
细胞遗传验证技术：利用siRNA/shRNA敲减、过表达等技术构建修饰酶细胞遗传模型，观察靶蛋白泛素化水平的变化。
5. 泛素修饰类型与靶蛋白修饰位点的鉴定
使用HA-Ub-WT/KO泛素修饰系统检测修饰类型：使用HA-Ub-WT和HA-Ub-KO（K6，K11，K27，K29，K33，K48和K63）载体，分别与泛素连接酶（E3）和修饰底物共转染细胞，通过CoIP-WB检测底物泛素化水平，明确泛素连接酶对修饰底物的泛素修饰类型。或再次使用HA-Ub-WT（K6R，K11R，K27R，K29R，K33R，K48R和K63R）载体，分别与泛素连接酶（E3）和修饰底物共转染细胞，通过CoIP-WB检测底物泛素化水平，再次明确泛素连接酶对修饰底物的泛素修饰类型。
使用靶蛋白修饰位点突变鉴定修饰位点：结合生物信息学在线工具（UbPred和GPS-Uber），预测可能的泛素化位点，构建靶蛋白的位点突变体，与HA-Ub-WT质粒和E3连接酶共转染细胞，通过CoIP-WB检测底物泛素化水平，明确修饰底物的关键修饰位点。
靶蛋白修饰突变体构建验证：构建靶蛋白的泛素化位点突变体，通过比较野生型与突变体的功能差异，验证泛素化位点的功能。
6. 靶蛋白泛素修饰的功能与机制解析
信号通路分析：利用RNA-seq转录组和4D-DIA蛋白组等技术，分析泛素化修饰如何影响靶蛋白参与的信号通路。
CoIP-Mass检测或HuProt蛋白组芯片检测技术：筛选与靶蛋白相互作用的关键机制分子。
CoIP-WB检测和功能验证：不同泛素修饰状态下，靶蛋白和下游机制分子的互作变化，以及这些变化对机制分子的功能影响。
总结：通过以上机制探索研究思路，可以全面深入地揭示泛素化修饰在细胞生理和病理过程中的作用机制，为疾病诊疗提供新的靶点和策略。如您有泛素修饰方面的科研问题，欢迎随时来撩！
