肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌最常见的类型。HCC 的肿瘤干细胞（CSCs）是引发肝癌病变异质性和促进肿瘤复发、转移、治疗耐药的重要原因。因此，了解 CSCs 发生和发展的调控机制将为改善 HCC 患者预后提供机会。
2023年9月，中国医学科学院/北京协和医学院与同济大学团队合作在Nat Commun杂志上，发表“SCARB2 drives hepatocellular carcinoma tumor initiating cells via enhanced MYC transcriptional activity”的研究成果。该研究揭示SCARB2作为HCC的调节剂和潜在治疗靶点。
图形摘要：
Highlights如下：
1）CRISPR/Cas9敲除文库筛选，SCARB2的缺失抑制肝癌细胞的肿瘤干细胞样特性。
2）敲除SCARB2可减弱HCC的发生和进展。
3）机制上，SCARB2与MYC结合通过干扰HDCA3介导的MYC赖氨酸148去乙酰化促进MYC乙酰化，进而增强MYC转录活性。
表型相关性：SCARB2 对于维持 HCC 细胞的干细胞样特性具有重要作用。
功能研究：SCARB2 缺失降低肿瘤生长和转移能力。
机制研究：
（1）SCARB2促进HCC发病的机制
通过转录组测序和GSEA分析，发现SCARB2敲除组MYC靶基因标签的高度富集（图1a）。荧光素酶实验显示SCARB2敲除降低HCC细胞中MYC的转录活性（图1b）。ChIP-qPCR表明敲除SCARB2降低了MYC与MYC靶基因的结合（图1c）。表明SCARB2通过增强MYC转录活性及其靶基因的表达来促进肝癌的发生。
（2）SCARB2如何调控MYC转录活性
第一步，SCARB2是否影响MYC蛋白修饰
翻译后修饰在控制MYC的表达和活性中起关键作用。Anti-MYC IP-WB实验发现，SCARB2正向调控MYC蛋白乙酰化修饰水平（图1d)。定量质谱(MS)蛋白质组学发现，MYC的赖氨酸(K) 148和326乙酰化肽在SCARB2过表达组富集。构建MYC-K148R和K326R突变体，anti-MYC IP-WB实验发现，过表达SCARB2只减弱MYC-K148R乙酰化修饰水平（图1e）。表明SCARB2上调MYC-K148乙酰化。
第二步，SCARB2通过何种分子影响MYC蛋白乙酰化修饰
研究表明p300、HDACs、KAT5、SIRT1和GCN5以直接和间接的方式影响MYC的乙酰化和去乙酰化。通过IP-WB筛选发现，过表达SCARB2可恢复由去乙酰化酶HDAC3介导的MYC乙酰化降低（图1f），表明SCARB2主要以HDAC3依赖的方式影响MYC乙酰化。
第三步，MYC蛋白乙酰化修饰影响MYC转录活性
荧光素酶实验显示，K148R突变降低了MYC的转录活性（图1g）。ChIP-qPCR结果显示，MYC-K148R突变减少了MYC与其靶基因的结合（图1h）。研究显示位于MYC-CT结构域的K148介导MYC与GCN5、KAT5和BRD4等辅因子的相互作用，Co-IP实验验证了该结论（图1i）。功能实验发现，MYC-K148R突变的HCCLM3细胞的增殖能力和球形成能力显著降低（图1j）。表明，SCARB2增强的MYC-K148乙酰化为关键辅因子提供对接位点，对MYC的转录活性至关重要（图1k）。
图1 SCARB2通过MYC-K148位点破坏hdac3介导的MYC去乙酰化（Ref. Fig 3/4）
（3）分子互作机制
第一步，找SCARB2的互作蛋白
通过IP-MS分析发现MYC、HDAC3是潜在的相互作用蛋白（图2a）。Co-IP实验证实MYC与SCARB2和HDAC3互作（图2b-d）。Co-IP实验发现MYC和SCARB2互作位于细胞质和细胞核（图2e）。此外，Co-IP还发现SCARB2的缺失增加了HDAC3与MYC的互作，而SCARB2的过表达减少了HDAC3与MYC的互作（图2f-g）。
第二步，确定互作的结构域
针对MYC的结构域构建不同突变体进行Co-IP实验，MYC的CT元件和 NTD结构域负责MYC与SCARB2和HDAC3的相互作用（图2h），表明SCARB2与HDAC3共享MYC的相同相互作用域。反过来，针对SCARB2的结构域构建不同突变体进行Co-IP实验，LD结构域的缺失显著降低了SCARB2和MYC的互作，表明LD结构域是互作的主要因素（图2i）。然后，评估HDAC3抑制对MYC与染色质结合的影响。ChIP-qPCR显示RGFP966抑制HDAC3增加了MYC与MYC靶基因的结合（图2j）。
图2 SCARB2与MYC互作破坏HDAC3介导的MYC去乙酰化（Ref. Fig5）
（4）筛选小分子抑制SCARB2分子机制
使用AutoDock Vina进行虚拟筛选和结合分析，以识别靶向SCARB2 LD结构域的小分子（图3a）。根据FDA批准的药物的模拟结合能选择前10种化合物（图3b），并分析检测这10种候选SCARB2抑制剂的结合能力。四种药物——醋酸戈舍瑞林、鞣酸、多黏菌素B (PMB)和丙氨瑞林显示出与SCARB2结合，其中PMB与SCARB2具有较高的结合亲和力（图3c）。Co-IP实验显示PMB抑制了SCARB2与MYC的相互作用（图3d），降低了MYC乙酰化、MYC与染色质结合以及MYC转录活性（图3e-f）。表明PMB破坏SCARB2-MYC相互作用，随后降低MYC乙酰化和活性，
以对抗HCC进展。
图3 PMB与SCARB2结合抑制HDAC3介导的MYC乙酰化和MYC转录活性（Ref. Fig6）
结论：首先，本研究通过 CRISPR/Cas9 敲除文库筛选鉴定到 SCARB2 基因缺失抑制 HCC 细胞的癌干细胞样特性。进一步转录组测序发现 SCARB2 通过增强 MYC 活性来调节 HCC 癌干细胞样特性，在促进 HCC 发生和进展中发挥重要作用。机制上，在机制上，SCARB2与MYC的结合，干扰HDCA3介导的MYC-K148去乙酰化，进而促进MYC乙酰化，从而增强MYC转录活性。多黏菌素B对SCARB2蛋白具有高结合亲和力，破坏SCARB2-MYC相互作用，降低MYC活性并减轻肿瘤负荷。揭示了SCARB2作为HCC的调节剂和潜在的治疗靶点。
2023年9月，中国医学科学院/北京协和医学院与同济大学团队合作在Nat Commun杂志上，发表“SCARB2 drives hepatocellular carcinoma tumor initiating cells via enhanced MYC transcriptional activity”的研究成果。该研究揭示SCARB2作为HCC的调节剂和潜在治疗靶点。
图形摘要：
Highlights如下：
1）CRISPR/Cas9敲除文库筛选，SCARB2的缺失抑制肝癌细胞的肿瘤干细胞样特性。
2）敲除SCARB2可减弱HCC的发生和进展。
3）机制上，SCARB2与MYC结合通过干扰HDCA3介导的MYC赖氨酸148去乙酰化促进MYC乙酰化，进而增强MYC转录活性。
表型相关性：SCARB2 对于维持 HCC 细胞的干细胞样特性具有重要作用。
功能研究：SCARB2 缺失降低肿瘤生长和转移能力。
机制研究：
（1）SCARB2促进HCC发病的机制
通过转录组测序和GSEA分析，发现SCARB2敲除组MYC靶基因标签的高度富集（图1a）。荧光素酶实验显示SCARB2敲除降低HCC细胞中MYC的转录活性（图1b）。ChIP-qPCR表明敲除SCARB2降低了MYC与MYC靶基因的结合（图1c）。表明SCARB2通过增强MYC转录活性及其靶基因的表达来促进肝癌的发生。
（2）SCARB2如何调控MYC转录活性
第一步，SCARB2是否影响MYC蛋白修饰
翻译后修饰在控制MYC的表达和活性中起关键作用。Anti-MYC IP-WB实验发现，SCARB2正向调控MYC蛋白乙酰化修饰水平（图1d)。定量质谱(MS)蛋白质组学发现，MYC的赖氨酸(K) 148和326乙酰化肽在SCARB2过表达组富集。构建MYC-K148R和K326R突变体，anti-MYC IP-WB实验发现，过表达SCARB2只减弱MYC-K148R乙酰化修饰水平（图1e）。表明SCARB2上调MYC-K148乙酰化。
第二步，SCARB2通过何种分子影响MYC蛋白乙酰化修饰
研究表明p300、HDACs、KAT5、SIRT1和GCN5以直接和间接的方式影响MYC的乙酰化和去乙酰化。通过IP-WB筛选发现，过表达SCARB2可恢复由去乙酰化酶HDAC3介导的MYC乙酰化降低（图1f），表明SCARB2主要以HDAC3依赖的方式影响MYC乙酰化。
第三步，MYC蛋白乙酰化修饰影响MYC转录活性
荧光素酶实验显示，K148R突变降低了MYC的转录活性（图1g）。ChIP-qPCR结果显示，MYC-K148R突变减少了MYC与其靶基因的结合（图1h）。研究显示位于MYC-CT结构域的K148介导MYC与GCN5、KAT5和BRD4等辅因子的相互作用，Co-IP实验验证了该结论（图1i）。功能实验发现，MYC-K148R突变的HCCLM3细胞的增殖能力和球形成能力显著降低（图1j）。表明，SCARB2增强的MYC-K148乙酰化为关键辅因子提供对接位点，对MYC的转录活性至关重要（图1k）。
图1 SCARB2通过MYC-K148位点破坏hdac3介导的MYC去乙酰化（Ref. Fig 3/4）
（3）分子互作机制
第一步，找SCARB2的互作蛋白
通过IP-MS分析发现MYC、HDAC3是潜在的相互作用蛋白（图2a）。Co-IP实验证实MYC与SCARB2和HDAC3互作（图2b-d）。Co-IP实验发现MYC和SCARB2互作位于细胞质和细胞核（图2e）。此外，Co-IP还发现SCARB2的缺失增加了HDAC3与MYC的互作，而SCARB2的过表达减少了HDAC3与MYC的互作（图2f-g）。
第二步，确定互作的结构域
针对MYC的结构域构建不同突变体进行Co-IP实验，MYC的CT元件和 NTD结构域负责MYC与SCARB2和HDAC3的相互作用（图2h），表明SCARB2与HDAC3共享MYC的相同相互作用域。反过来，针对SCARB2的结构域构建不同突变体进行Co-IP实验，LD结构域的缺失显著降低了SCARB2和MYC的互作，表明LD结构域是互作的主要因素（图2i）。然后，评估HDAC3抑制对MYC与染色质结合的影响。ChIP-qPCR显示RGFP966抑制HDAC3增加了MYC与MYC靶基因的结合（图2j）。
图2 SCARB2与MYC互作破坏HDAC3介导的MYC去乙酰化（Ref. Fig5）
（4）筛选小分子抑制SCARB2分子机制
使用AutoDock Vina进行虚拟筛选和结合分析，以识别靶向SCARB2 LD结构域的小分子（图3a）。根据FDA批准的药物的模拟结合能选择前10种化合物（图3b），并分析检测这10种候选SCARB2抑制剂的结合能力。四种药物——醋酸戈舍瑞林、鞣酸、多黏菌素B (PMB)和丙氨瑞林显示出与SCARB2结合，其中PMB与SCARB2具有较高的结合亲和力（图3c）。Co-IP实验显示PMB抑制了SCARB2与MYC的相互作用（图3d），降低了MYC乙酰化、MYC与染色质结合以及MYC转录活性（图3e-f）。表明PMB破坏SCARB2-MYC相互作用，随后降低MYC乙酰化和活性，
以对抗HCC进展。
图3 PMB与SCARB2结合抑制HDAC3介导的MYC乙酰化和MYC转录活性（Ref. Fig6）
结论：首先，本研究通过 CRISPR/Cas9 敲除文库筛选鉴定到 SCARB2 基因缺失抑制 HCC 细胞的癌干细胞样特性。进一步转录组测序发现 SCARB2 通过增强 MYC 活性来调节 HCC 癌干细胞样特性，在促进 HCC 发生和进展中发挥重要作用。机制上，在机制上，SCARB2与MYC的结合，干扰HDCA3介导的MYC-K148去乙酰化，进而促进MYC乙酰化，从而增强MYC转录活性。多黏菌素B对SCARB2蛋白具有高结合亲和力，破坏SCARB2-MYC相互作用，降低MYC活性并减轻肿瘤负荷。揭示了SCARB2作为HCC的调节剂和潜在的治疗靶点。
